Změny metabolismu hyaluronanu ve zdravé a fotostárnutím poškozené pokožce

Mgr. Romana Šínová, Ph.D.

Doctoral thesis

The changes in hyaluronan metabolism in healthy and photoaged skin

Abstract:

Hyaluronan (HA) je klíčovou složkou extracelulární matrix, přičemž v lidském těle je více než polovina celkového HA přítomna v kůži. HA má velmi dobrou schopnost vázat vodu, díky čemuž je kůže hydratovaná a elastická. Novější studie poukazují na aktivní roli HA v ovlivňování mnoha rozmanitých fyziologických i patofyziologických procesů. Jeho specifická biologická aktivita je široce využívána v lékařském a kosmetickém průmyslu. Cíle práce jsou vyvinout metodické přístupy pro detekci HA v kůži, pomoci porozumět degradaci HA v kůži, objasnit změny v metabolismu HA po UV ozáření a zjistit, zda topicky aplikovaná HA proniká hlouběji do kůže. Nejprve byla optimalizována histofluorescenční technika detekce HA, zejména přesná distribuce HA v histologických vzorcích kůže pomocí konfokální mikroskopie. Výsledky ukázaly, že lokalizace HA je velmi podobná v lidské i prasečí kůži, zejména hojnost HA v papilární dermis ve srovnání s epidermis. Další část této práce byla zaměřena na expresi a aktivitu HYAL (hyaluronidáz) a dalších proteinů podílejících se na degradaci HA ve zdravé lidské pokožce. Cílem bylo poskytnout ucelený přehled a navrhnout mechanismus degradace HA ve zdravé kůži. Zjistili jsme typickou tkáňovou a subcelulární lokalizaci HYAL1 a HYAL2 v souladu s nedávnou literaturou. Poprvé jsme však popsali přítomnost CEMIP (Cell Migration Inducing Hyaluronidase I) v epidermis, konkrétně intracelulárně ve stratum basale. Dále byla prokázána přítomnost CEMIP2 (Cell Migration Inducing Hyaluronidase II) v epidermis i dermis. Naše výsledky ukazovaly převažující roli HYAL2 v degradaci nativního vysokomolekulárního HA v kůži. Výše získané poznatky byly využity pro studium změn metabolismu HA v reakci kůže na UV ozáření. Dosavadní literatura ukazuje kontroverzní výsledky, zejména z důvodů použití různých modelů, organismů, dávky UV, interval odběru vzorku po ozáření. Z literatury není patrný jasný trend ve změnách množství a MW HA v kůži vlivem UV ozáření. Proto jsem využila několik různých modelů včetně lidské kůže in vivo, 3D rekonstituované epidermis in vitro a 2D kultivovaných keratinocytů in vitro. Získaná data ukazovala zvýšené množství HA v kůži po akutním UV ozáření a také zvýšenou expresi různých HAS (hyaluronan syntázy) a HYAL. Poprvé byla prokázána významně zvýšená exprese CEMIP a CEMIP2 po akutním UV ozáření. Také tři použité epidermální modely se lišily v některých genových expresích souvisejících s akutním UV ozářením. HA je součástí řady topicky aplikovaných produktů na kůži, nicméně není zcela objasněno, jestli HA penetruje do kůže, do jakých vrstev kůže a jaká je závislost na MW HA. Protože je HA přítomna v různém množství prakticky ve všech typech tkání, je studium penetrace HA náročné a je nutné odlišit endogenní a exogenní HA. Proto se tato práce dále zabývala studiem penetrace HA prasečí epidermis ve Franzových celách, kde bylo zjištěno, že 290 kDa HA proniká přes stratum corneum a akumuluje se v epidermální bazální vrstvě, což bylo detekováno pomocí bHABP detekce HA. Předběžné výsledky s biotinylovanou HA ukázaly stejný vzor epidermální penetrace a tato metoda je také vhodná pro studium penetrace celou kůží. Celkově poznatky získané v rámci této disertační práce rozšířili znalosti o HA, hlavní složce extracelulární matrix kůže, a přinášejí nové možnosti využití HA v dermatologii, vývoji systémů podávání léků a produktů proti fotostárnutí.

Abstract:

Hyaluronan (HA) is a crucial component of the human extracellular matrix, and more than half of the total HA is present in the skin. HA has an excellent ability to bind to water, which makes the skin hydrated and elastic. New studies show the active role of HA in many physiological and pathophysiological processes. Its specific biological activity is widely taken advantage of in the medical and cosmetic industries. This work aimed to develop methodological approaches for the detection of HA in the skin, to help understand the degradation of HA in the skin, to elucidate changes in HA metabolism following UV irradiation, and to find out if topically applied HA penetrates deeper into the skin. First, the HA detection histofluorescent technique was optimized, mainly the exact distribution of HA in the skin histological specimens using confocal microscopy. The results indicated that the localization of HA showed many similarities in both human and porcine skin, mainly the abundance of HA in the papillary dermis compared to the epidermis. Another part of this thesis focused on the expression and activities of hyaluronidases (HYALs) and other HA-degrading proteins in normal human skin. The aim was to provide a comprehensive overview and to propose the HA degradation mechanism in healthy skin. Considering the HYAL1 and HYAL2 were observed typical tissue and subcellular localization consistent with recent literature. However, for the first time, we described the presence of Cell Migration Inducing Hyaluronidase (CEMIP) in the epidermis, specifically intracellularly in the stratum basale. The presence of Cell Migration Inducing Hyaluronidase II (CEMIP2) was demonstrated in the epidermis and dermis. Our results revealed a predominant role for HYAL2 in the degradation of native high molecular weight HA in the skin. These findings were used to study changes in HA metabolism in the skin response to UV irradiation. The existing literature shows controversial results, mainly due to different models, organisms, UV doses, and sampling intervals after irradiation. There is no clear trend in changes in the amount and MW HA in the skin due to UV exposure in the literature. Therefore, we used several different models, including human skin in vivo, 3D reconstituted epidermis in vitro and 2D cultured keratinocytes in vitro. Our data demonstrated an increased amount of HA in the skin following acute UV irradiation and increased expression of various hyaluronan synthases (HASs) and HYALs. For the first time, a significantly increased expression of CEMIP and CEMIP2 was demonstrated following acute UV irradiation. Also, the three utilized epidermal models showed significant differences in their gene-expression response to acute UV irradiation. HA is included in several topically applied skin products; however, it is not fully understood whether HA penetrates the skin, which layers of the skin, and the dependence on MW HA. HA is present in varying amounts in all tissues; therefore, studying HA penetration is challenging, and it is necessary to distinguish between endogenous and exogenous HA. Therefore, this work studied the penetration of HA through the porcine epidermis in Franz cells, finding that 290 kDa HA penetrated the stratum corneum and accumulated in the basal layer of the epidermis using previously established bHABP detection of HA. The preliminary results with biotinylated HA showed the same pattern of epidermal penetration, and this method is also suitable for studying penetration in full-thickness skin. Together, these results broaden the knowledge about the main component of the extracellular matrix of the skin and bring new possibilities for its use in dermatology, the development of drug delivery systems, and an anti aging approach.

Keywords

skin, photoaging, UV radiation, epidermis, hyaluronan, hyaluronidase, kůže, fotostárnutí, UV záření, hyaluronidázy

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 11. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 27. 1. 2023
• Supervisor: Mgr. Kristina Nešporová, Ph.D.
• Reader: Ing. Lucie Vištejnová, Ph.D., Abigail Langton, PhD

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Animal physiology, immunology and developmental biology / Animal physiology, immunology and developmental biology