Imobilizace lysozymu na magnetické mikročástice pro účely obohacení bakteriálních extraktů určených k identifikaci mikroorganismů

Mgr. Lucie Holubová

Master's thesis

Immobilization of lysozyme onto magnetic microparticles for the purpose of bacterial extracts enrichment aimed at an identification of microorganisms

Abstract:

Diplomová práce byla zaměřena na vytipování a zavedení vhodné metody pro stanovení aktivity solubilního lysozymu, přípravu magnetického nosiče s imobilizovaným lysozymem a moţnost praktického vyuţití jak solubilní tak imobilizované formy lysozymu pro fragmentaci buněčné stěny grampozitivních bakterií. Aktivita solubilního a následně imobilizovaného lysozymu, stejně jako optimalizace reakčních podmínek byla provedena s vyuţitím různých druhů syntetických substrátů, ze kterých se pro naše účely nejlépe osvědčil fluorescenční substrát 4-methylumbelliferyl-ß-D-N,N´,N´´-triacetylchitotriosid. Pro přípravu bioaktivního nosiče vyuţitelného k fragmentaci buněčné stěny grampozitivních bakterií byly vybrány magnetické částice s karboxylovými a hydroxylovými funkčními skupinami s rozdílnou velikostí částic a porozitou. Na základě výsledků byl vybrán nejvhodnější nosič, u kterého byla stanovena skladovací a operační stabilita imobilizovaného lysozymu. Obě formy enzymu byly následně pouţity k fragmentaci buněčné stěny bakterií s následnou identifikací pomocí MALDI - TOF MS.

Abstract:

Diploma thesis was focused on prediction and implementation of suitable method for the determination of the activity of soluble lysozyme, preparation of magnetic carrier with immobilized lysozyme and the possibility of practical utilization of soluble and immobilized forms of lysozyme for fragmentation of the cell wall of grampositive bacteria. The activity of soluble lysozyme and subsequently immobilized lysozyme, as well as an optimization of reaction conditions has been performed using various types of synthetic substrates, from which the fluorescent substrate 4-methylumbelliferyl-ß-D-N,N',N''-triacetylchitotriosid was the most beneficial for our purposes. Magnetic particles with carboxyl and hydroxyl functional groups of different size of particles and porosity were chosen for preparation of the bioactive carrier subsequently used for fragmentation of the cell wall of grampositive bacteria. Based on the results, the most convenient carrier has been selected, in which the storage and operational stability of immobilized lysozyme was determined. Both forms of enzyme were subsequently used to fragmentation of cell walls bacteria for identification by MALDI - TOF MS analysis.

Keywords

lysozym, imobilizace, magnetické nosiče, buněčná stěna, MALDI, TOF MS identifikace bakterií

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 5. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 2. 6. 2010
• Supervisor: RNDr. Lucie Korecká, Ph.D.

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Master programme / field:
Special Chemical and Biological Programmes / Analysis of Biological Materials