Analýza exprese a funkce signální dráhy HGF/MET v buněčných liniích derivovaných z osteosarkomu

Bc. Veronika Kozlová

Master's thesis

Analysis of HGF/MET signaling pathway in osteosarcoma derived cell lines

Abstract:

Signální dráha HGF/Met se skládá z tyrozin kinázového receptoru Met a jeho ligandu hepatocytárního růstového faktoru (HGF). Navázání HGF na receptor Met vyústí ve fosforylaci a aktivaci receptoru Met, což vede ke spuštění navazujících signalizačních kaskád, které mají v konečném důsledku vliv na buněčnou proliferaci, diferenciaci, migraci a přežití buněk. Souhrnně tedy buněčný proces, který můžeme nazvat invazivní růst. Tento invazivní růst je esenciální během embryonálního vývoje, regenerace orgánů ale také v tumorigenezi. Aktivace dráhy HGF/Met se pak objevuje zejména u agresivních typů nádorů, které mají tendenci se šířit do okolních tkání a jsou odolné vůči chemoterapii. Aberantní aktivace signální dráhy HGF/Met se objevuje i u osteosarkomů, jejichž léčba bývá velmi problematická. Je tedy snahou najít nové inhibiční strategie léčby osteosarkomu a inhibice signální dráhy HGF/Met by mohla být vhodným kandidátem pro cílenou terapii. Tato diplomová práce se zabývá charakterizací signální dráhy HGF/Met u buněčných linií osteosarkomu, konkrétně u referenční linie Saos-2 a u 5 osteosarkomových buněčných linií derivovaných z pacientů. Pomocí metody RT-PCR byla zjištěna exprese Met i HGF ve všech osteosarkomových liniích derivovaných z pacientů. S využitím metody Westernového přenosu a proteinové array byl analyzován fosforylační profil MAPK, serin/threoninových kináz a dalších proteinů, které by se mohly účastnit signální dráhy HGF/Met v buňkách osteosarkomu. Součástí práce byla i aplikace inhibitorů (Crizotinib, Tivantinib) a sledování jejich vlivu na aktivaci signální dráhy HGF/Met. Byl také analyzován vliv inhibitorů na proliferaci a viabilitu osteosarkomových buněk pomocí MTT testu. Metodou nepřímé imunofluorescence byl analyzován vliv inhibitorů na cytoskeletální mikrotubuly. Na základě získaných výsledků lze konstatovat, že aktivace signální dráhy HGF/Met v buňkách osteosarkomu vyústila v aktivaci MAPK a serin/threoninových kináz, zejména pak kináz Erk2 a Akt2. Dalším závěrem pak je, že Crizotinib je potencionálně využitelný jako specifický inhibitor aktivace receptoru Met, zatímco Tivantinib měl jen omezený vliv na aktivaci receptoru Met a u osteosarkomových buněk měla jeho aplikace vliv spíše na depolymerizaci mikrotubulů.

Abstract:

The HGF/Met signaling pathway consists of Met tyrosine kinase receptor and its ligand Hepatocyte growth factor (HGF). HGF binding to Met receptor results in its phosphorylation and activaon, leading to activation of wide range of different cellular signaling pathways. These include proliferation, differentiation, migration and cell survival, which can be summarized as an invasive growth. The invasive growth is essential during embryonic development, organ regeneration but also in tumorigenesis. Activation of the HGF/Met signaling pathway appears particularly in aggressive types of tumors, which tend to spread into surrounding tissues and are resistant to chemotherapy. Aberrant activation of the HGF/Met signaling pathway occurs in osteosarcoma, which is very problematic to treat. The goal is to find new strategies for the treatment of osteosarcoma and inhibition of the HGF/Met signaling pathway could be a good candidate for targeted therapy. The diploma thesis is focused on the characterization of HGF/Met signaling pathway in osteosarcoma cell lines, specifically reference cell line Saos-2 and five osteosarcoma cell lines derived from patients. The expression of Met and HGF was determined by RT-PCR in all the lines derived from osteosarcoma patients. Using the techniques of Western blotting and protein array, we analyzed phosphorylation profile of MAPK and serine/threonine kinases and other proteins that could be involved in the HGF/Met signaling pathway in osteosarcoma cell. We also applied two inhibitors (Crizotinib, Tivantinib) and monitored their effect on activation HGF/Met signaling pathway in osteosarcoma. The influence of these inhibitors on proliferation and cell viability was analyzed by the MTT assay. The effect of inhibitors on the cytoplasmic microtubules was analyzed using indirect immunofluorescence. Based on achieved results we can conclude that the activation of the HGF/Met signaling pathway in osteosarcoma cells leads to activation of the MAPK and serine/threonine kinases, especially Erk2 and Akt2. Another conclusion is that Crizotinib is potentially applicable as a specific inhibitor of Met receptor activation in osteosarcoma, but Tivantinib has only limited influence on the activation of the Met receptor and causes depolymerization of microtubules in osteosarcoma cells.

Keywords

hepatocytární růstový faktor, HGF, receptor Met, osteosarkom, inhibitor, Crizotinib, Tivantinib

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 5. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 3. 6. 2015
• Supervisor: doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics